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pk10规律

2018-09-20 19:35

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  SOD(超氧化物歧化酶)活性测定 氮蓝四唑法 一、道理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)遍及具有动、动物的体内,是一种断根超 氧阴离子自在基的酶,它催化下面的反映: + o.2 +H H O 2 2+ O2 反映产品 H2O2 可由过氧化氢酶进一步分化或被过氧化物酶操纵。超氧化物歧化酶抑止氮蓝 四唑(NBT)在光下的还原感化来确定酶活性的大小。在有氧化物质存鄙人,核黄素可被光还 原, 被还原的核黄素在有氧前提下极易被氧化而发生超氧阴离子, 超氧阴离子可将氮蓝四唑 还原为蓝色的甲腙,后者在 560nm 处有最大接收。而 SOD 可断根超氧阴离子,从而抑止了 甲腙的构成。 于是光还原反映后, 反映液蓝色愈深, 申明酶的活性愈低, 反之酶的活性俞高。 据此可计较出酶活性的大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 动物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备 冰箱、低温高速离心计心情、微量加样器 (1mL、20μL、100μL)、移液管、细密电子天 平、UV-752 型紫外分光光度计、试管、研钵、铰剪、镊子、荧光灯(反招考管处照 度为 4000Lux 或 Lx) (三)试剂 (1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。 (2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至 100mL。 (3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至 100mL,避光 保留。 (4)100μmol/LEDTA-Na2 溶液: 称取 0.03721g EDTA-Na2, 用磷酸缓冲液定溶 1000mL。 (5)20μmol/L 核黄素溶液:称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到 1000mL,避光保留。 三、试验步调 (一)酶液的提取 (1)称取动物材料(去叶脉)0.2g,加 1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲 液使体积为 5mL。取 2mL 于 1000r/min 下离心 20min,上清液即为 SOD 粗提液。 (二)显色反映 取 5mL 的试管(要求通明度好)若干,有对照、处置。按下表加样: 试剂(酶) 0.05mol/L 磷酸缓冲液 130mmol/Lmet 溶液 750μmol/LNBT 溶液 100μmol/L EDTA-Na2 液 20μmol/L 核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 用量/mL 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 13mmol/L 75μmol/L 10μmol/L 2.0μmol/L 对照液用缓冲液 终浓度/比色时 夹杂后将一支对看管置暗处,其他各管于 4000Lx 日光下反映 20min。 (三)SOD 活性测定与计较 至反映竣事后,以不照光的对看管做空白,别离测定其他管的吸光度。 四、计较酶活力 已知 SOD 活力单元以抑止氮蓝四唑光还原的 50%为一个酶活力单元暗示,按下式计较 SOD 活性。 SOD 总活力=[(ACK-AE)× V]/(0.5× ACK× W× Vt) SOD 比活力= SOD 总活力/卵白质含量 公式中:SOD 总活力以鲜重酶单元每克暗示;比活力单元以酶单元每毫克卵白暗示; ACK 为照光对看管的吸光值;AE 为样品管的吸光度;V 为样品液总体积,mL;Vt 为测按时 样品用量,mL;W 为样品鲜重,g;卵白质含量单元为 mg/g。

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